2016年1月，回國(guó)不滿半年的張余，在《中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心人員遴選申請(qǐng)書》里寫到：“申請(qǐng)人擬開展的工作是運(yùn)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究葉綠體編碼的RNA聚合酶（PEP）的工作機(jī)理和調(diào)控機(jī)制。”
8年后，張余團(tuán)隊(duì)和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)副教授周菲團(tuán)隊(duì)合作，解析了PEP的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并揭示了該葉綠體基因轉(zhuǎn)錄“機(jī)器”的“裝配部件”“裝配模式”“功能模塊”，為葉綠體光合作用的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用探索打下了基礎(chǔ)。2024年3月1日，相關(guān)研究成果以封面文章形式發(fā)表于《細(xì)胞》。
文章封面圖 受訪者供圖（下同）
“植物學(xué)領(lǐng)域的前沿科學(xué)問題，很多都是生命科學(xué)的共性問題。”中國(guó)科學(xué)院院士、中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（以下簡(jiǎn)稱分子植物卓越中心）主任韓斌告訴《中國(guó)科學(xué)報(bào)》，這項(xiàng)工作填補(bǔ)了RNA聚合酶（RNAP）領(lǐng)域的空白，是可以寫進(jìn)教科書里的突破性進(jìn)展，將帶動(dòng)后續(xù)一系列應(yīng)用上的探索。
領(lǐng)域里最有挑戰(zhàn)性的難題
如果將細(xì)胞比喻為一臺(tái)精密運(yùn)轉(zhuǎn)的電腦，基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器——RNAP則是轉(zhuǎn)錄過程中的“中央處理器（CPU）”，其重要性不言而喻。“遺傳信息被存儲(chǔ)在了基因組這塊‘硬盤’中，必須借助于CPU讀取細(xì)胞中的各類數(shù)據(jù)，并經(jīng)過整合各方信號(hào)輸出指令，才能開始后續(xù)的生命活動(dòng)。”張余解釋。
隨著對(duì)此類“CPU”認(rèn)識(shí)的不斷深入，人們驚奇地發(fā)現(xiàn)，盡管生物種類眾多，RNAP卻十分保守。
幾十年間，人們陸續(xù)解析了細(xì)菌、古菌、真核生物RNAP的結(jié)構(gòu)和工作機(jī)制。但對(duì)植物特有RNAP的解析則進(jìn)展緩慢，一直到近幾年，植物特有的Pol IV的結(jié)構(gòu)和機(jī)制才被闡明——這項(xiàng)工作由張余以及分子植物卓越中心研究員王佳偉合作完成。
而PEP的構(gòu)造遲遲不現(xiàn)“廬山真面目”，事實(shí)上，光對(duì)其進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，就足足經(jīng)歷了32年時(shí)間。
原因在于其結(jié)構(gòu)過于復(fù)雜。“這是一個(gè)持續(xù)發(fā)現(xiàn)的過程。可能這一年發(fā)現(xiàn)某一蛋白是RNAP的亞基組分，過兩年又發(fā)現(xiàn)了一個(gè)。”張余介紹。
植物葉綠體的“祖先”是原核藍(lán)細(xì)菌，在15億年的演化時(shí)間里，藍(lán)細(xì)菌基因組基因不斷被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，同時(shí)細(xì)胞核基因也不斷加強(qiáng)對(duì)葉綠體的調(diào)控。
演化至今，葉綠體基因組變得“小而精”，轉(zhuǎn)錄葉綠體基因組的機(jī)器卻越發(fā)復(fù)雜。PEP在原核藍(lán)細(xì)菌基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器的基礎(chǔ)上，裝配了多個(gè)獨(dú)特的功能模塊，“身形”變?yōu)樵瓉淼?.5倍，其“裝配部件”數(shù)量變?yōu)樵瓉淼?倍。然而這些模塊在原核藍(lán)細(xì)菌中卻基本沒有任何“原型”，大多數(shù)“借”于真核細(xì)胞。
多年研究表明，葉綠體基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器控制葉綠體的發(fā)育過程以及成熟葉綠體的基因表達(dá)，在調(diào)控植物光合作用中發(fā)揮關(guān)鍵角色。“可以認(rèn)為，PEP是領(lǐng)域內(nèi)最重要、最有挑戰(zhàn)性的難題。”王佳偉介紹。
科研是一場(chǎng)沒有硝煙的競(jìng)爭(zhēng)
回國(guó)后的八年間，張余和他的團(tuán)隊(duì)，聚焦于細(xì)菌、酵母和植物的細(xì)胞核與細(xì)胞器RNAP，并持續(xù)有成果產(chǎn)出。
但PEP的結(jié)構(gòu)解析，在很長(zhǎng)的一段時(shí)間里都沒有進(jìn)展。
“最大的瓶頸是如何從葉綠體中純化豐度非常低的RNA聚合酶，我們嘗試了多種手段，都以失敗告終。”張余回憶，“比如我們沿用解析Pol IV時(shí)的一個(gè)方法，用擬南芥懸浮細(xì)胞去純化植物內(nèi)源蛋白，但目前擬南芥中葉綠體轉(zhuǎn)化的效率非常低，很難把穩(wěn)定的蛋白標(biāo)簽插入到葉綠體的基因組中。”
2019年，德國(guó)馬普分子植物生理所所長(zhǎng)、德國(guó)科學(xué)院院士Ralph Bock在分子植物卓越中心進(jìn)行學(xué)術(shù)報(bào)告，介紹了他實(shí)驗(yàn)室在植物質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)和應(yīng)用領(lǐng)域的研究進(jìn)展。
張余茅塞頓開，意識(shí)到可以在PEP的基因序列中加上一段DNA序列作為標(biāo)簽，再通過親和純化的方式，把PEP從復(fù)雜的組分中“拉”出來，從而獲得葉綠體基因轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)復(fù)合物。
團(tuán)隊(duì)鎖定了葉綠體基因轉(zhuǎn)化效率較高的模式植物大葉煙草，又遇到了新的挑戰(zhàn)。“前期我們沒有種植煙草的經(jīng)驗(yàn)，剛開始種植的時(shí)候就遇到了‘蚜蟲災(zāi)害’，煙草一直長(zhǎng)不大，我們就天天用透明膠帶手工捕捉蚜蟲。最后通過對(duì)溫室和培養(yǎng)土進(jìn)行滅菌，進(jìn)行了根治。”文章一作、分子植物卓越中心副研究員武霄仙介紹。
張余與文章第一作者武霄仙（左）、穆文慧（右）合影
一直到2022年年底，團(tuán)隊(duì)才建立了穩(wěn)定的純化流程，突破了PEP蛋白獲取的瓶頸。與此同時(shí)，國(guó)際上的競(jìng)爭(zhēng)十分激烈，陸續(xù)有幾個(gè)課題組在PEP純化及結(jié)構(gòu)解析方面取得了突破。
“我們當(dāng)時(shí)很緊張。”為了確保進(jìn)度，武霄仙還沒休完產(chǎn)假就回實(shí)驗(yàn)室投入了這項(xiàng)研究，經(jīng)常做實(shí)驗(yàn)做到半夜。“我的家里人也非常支持我的工作，能幫我照顧孩子、處理家中瑣事。”
此外，PEP復(fù)雜的結(jié)構(gòu)也為數(shù)據(jù)處理帶來了挑戰(zhàn)。在獲得蛋白冷凍電鏡結(jié)構(gòu)后，武霄仙發(fā)現(xiàn)PEP蛋白的二維分類中存在很多“洞”和“犄角”，三維結(jié)構(gòu)也很陌生。“文獻(xiàn)報(bào)道PEP由藍(lán)細(xì)菌RNAP進(jìn)化而來，但是我一點(diǎn)都找不到藍(lán)細(xì)菌RNAP的‘影子’，一度以為自己解析了一個(gè)‘雜蛋白’。”
最終，團(tuán)隊(duì)從較為熟悉的亞基入手，并基于前期文獻(xiàn)和AlphaFold結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將PEP亞基放置到了準(zhǔn)確位置，并很快開始了論文撰寫。
2023年6月，英國(guó)Michael Webster課題組在會(huì)議中報(bào)告了白芥PEP蛋白冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的相關(guān)進(jìn)展，最后兩個(gè)課題組商量“背靠背”共同發(fā)表。
“在這八年多時(shí)間里，我們之所以能夠一直堅(jiān)持下去，得益于中心營(yíng)造的比較寬松、讓青年人才能夠潛心去啃硬骨頭的一個(gè)氛圍。”張余強(qiáng)調(diào)。
補(bǔ)上最后一塊拼圖
與原核藍(lán)細(xì)菌基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器相比，PEP一共具有20個(gè)“裝配部件”（蛋白亞基），其中14種是其特有的。
研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，這些“部件”通過“套娃模型”進(jìn)行裝配：藍(lán)細(xì)菌來源的催化模塊包含6個(gè)“裝配部件”，位于復(fù)合物的核心層；支架模塊由7個(gè)部件組成，位于中間層，一方面可以穩(wěn)定催化模塊，另一方面為其他模塊提供結(jié)合位點(diǎn)；另有7種部件位于最外層，具有不同的功能特性。
在“套娃”最外層，分布著3個(gè)不同模塊。保護(hù)模塊包括2個(gè)蛋白亞基，它們具有超氧化物歧化酶的功能，保護(hù)PEP免受葉綠體中超氧化物的氧化攻擊；RNA模塊包括1個(gè)亞基，能夠序列特異性地結(jié)合RNA，推測(cè)可能參與轉(zhuǎn)錄關(guān)聯(lián)的RNA加工過程；調(diào)控模塊則由4個(gè)亞基組成，可能參與基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器的活性調(diào)控。
葉綠體基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器構(gòu)造
其中，催化模塊由葉綠體基因組編碼，蛋白亞基起源于藍(lán)細(xì)菌；其他模塊由細(xì)胞核基因組編碼，大部分蛋白亞基起源于真核細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)翻譯后運(yùn)輸至葉綠體完成組裝。
“這是一個(gè)非常巧妙的組裝模式，能夠保證細(xì)胞核控制葉綠體的基因表達(dá)。”張余解釋，“這些亞基需要在細(xì)胞核中完成轉(zhuǎn)錄、在細(xì)胞質(zhì)中完成翻譯，再運(yùn)輸?shù)饺~綠體中，同催化模塊組裝成完整的復(fù)合物，此時(shí)PEP才能夠發(fā)揮功能。”
張余指出，葉綠體基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器結(jié)構(gòu)的解析，意味著三域生物所有RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)類型均被闡明，“最后一塊拼圖”終于被補(bǔ)上。
在基礎(chǔ)研究層面，這項(xiàng)研究為進(jìn)一步探索葉綠體基因轉(zhuǎn)錄機(jī)器的工作模式、理解葉綠體的基因表達(dá)調(diào)控方式打下了基礎(chǔ)。
在應(yīng)用層面，則為改造葉綠體基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、增加光合作用復(fù)合物的基因表達(dá)、提高光合作用效率打下了基礎(chǔ)。比如通過提高光合作用基因表達(dá)增加作物生物量，進(jìn)而提高產(chǎn)量；提高植物的光合作用，理論上可以提高植物固定二氧化碳的能力，增加植物碳匯；合成生物學(xué)應(yīng)用層面，則為植物葉綠體生物反應(yīng)器的效率提升提供了著手點(diǎn)，可助力重組疫苗、重組蛋白藥物、和天然產(chǎn)物的生產(chǎn)。
但對(duì)于這一進(jìn)展，張余非常謙虛。“我覺得我們只是把研究葉綠體基因轉(zhuǎn)錄領(lǐng)域的門推開了。在整個(gè)轉(zhuǎn)錄過程中，還有很多其他蛋白和小分子的參與，需要在多個(gè)層面進(jìn)一步研究。”
相關(guān)論文信息：http://doi.org/10.1016/j.cell.2024.01.026
本文鏈接：三域生物RNA聚合酶“最后一塊拼圖”被補(bǔ)上http://m.sq15.cn/show-11-3439-0.html
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