近日，中國科學院分子植物科學卓越創新中心巫永睿團隊與張余團隊，聯合上海師范大學王文琴團隊，發現了植物質體DNA（ptDNA）復制體中RNA引物切除的核心核酸酶組分plastid-localized and Mn2+-dependent 5′-3′exonuclease 1（PEN1）。長期以來，植物ptDNA復制中負責RNA引物切除的核酸酶未被鑒定，而PEN1的發現填補了領域的空缺，完善了ptDNA復制理論。
DNA復制是生命科學的核心問題之一。雙鏈DNA解旋后，引物酶在模板鏈上合成RNA引物。前導鏈僅需合成一個RNA引物即可由高持續合成能力的DNA聚合酶實現連續延伸，滯后鏈需合成多個RNA引物，進而通過不連續的岡崎片段合成方式完成復制。DNA復制后，RNA引物由核酸酶負責切除，從而保證基因組的完整性。在原核生物中，DNA聚合酶III是負責DNA復制的酶，DNA聚合酶I是負責切除RNA引物的酶。DNA聚合酶I具有聚合酶活性及5′-3′外切酶活性。DNA聚合酶I在延伸DNA鏈時，同步利用其外切酶活性切除RNA引物。
在內共生過程中，光合藍細菌被非光合真核生物整合共生，進而演變成質體。質體是半自主的細胞器，Pol1A和Pol1B負責ptDNA復制，但缺乏類似于DNA聚合酶I的5′-3′外切酶結構域。目前，負責ptDNA復制過程RNA引物切除的核酸酶尚不清楚。研究發現，在擬南芥中，AtRNH1C可能參與RNA引物切除，而這一過程并非完全高效；AtRNH1C切割后，RNA-DNA連接處殘留1至3個核糖核苷酸，從而抑制DNA片段連接。因此，研究推測，需要其他尚未被鑒定的質體定位的核酸酶來完全切除RNA引物并允許DNA片段連接，進而確保ptDNA復制完成。
該研究分離Pen1位點，發現其編碼質體特異定位的5′-3′外切酶。PEN1與ptDNA復制體的其他成分即Pol1A/1B和連接酶LIG1共定位于葉綠體擬核。研究顯示，PEN1能夠高效切割RNA引物切除過程中間體，并完全移除RNA-DNA連接處的核糖核苷酸，從而促進LIG1連接。研究在體外重建了由PEN1、Pol1A/1B和LIG1介導的質體RNA引物去除過程，證實PEN1參與ptDNA復制過程RNA引物移除。
進一步，該研究解析了PEN1-雙鏈DNA二元復合物的晶體結構。在PEN1的催化中心，被切割DNA鏈的第1個核苷酸的5'單磷酸基團與活性中心的Mg2+形成配位鍵，且連接第2和第3個核苷酸的磷酸二酯鍵的同時與K250、R264、R283形成3個鹽橋，使被切割DNA鏈在活性中心的相對位置被固定，進而使PEN1精確切割第1個和第2個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，發揮核酸外切酶活性。為探討Pen1突變對ptDNA的影響，研究分離ptDNA和Detail-Seq發現，Pen1功能缺失導致ptDNA斷裂，且斷點主要積累在ptDNA正義鏈上。同時，研究顯示，Pen1功能缺失抑制ptDNA的復制和轉錄活性，從而影響質體的正常發育和功能。
上述研究發現質體特異性的5′-3′外切酶PEN1能夠直接催化質體DNA復制過程中RNA引物移除，并闡明了其結構基礎。這為質體復制尤其是RNA引物移除過程提供了進一步的理解，有望推動作物改良的質體遺傳工程進展。
6月25日，相關研究成果發表在《自然-植物》（Nature Plants）上。研究工作得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金、中國科學院戰略性先導科技專項（B類）等的支持。
論文鏈接
PEN1介導ptDNA復制RNA引物的移除
本文鏈接：研究揭示植物質體DNA復制中切除RNA引物的關鍵核酸酶及作用機制?http://m.sq15.cn/show-12-1399-0.html
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