復雜代謝途徑的高效重編程是構建高性能微生物細胞工廠的重要挑戰(zhàn)?？莶菅挎邨U菌作為具有GRAS安全認證的工業(yè)底盤菌，在蛋白質、維生素及類胡蘿卜素等高附加值產物的生物制造中具有應用前景。然而，實現多基因精細調控以優(yōu)化復雜代謝網絡面臨技術瓶頸，傳統(tǒng)的質粒文庫或啟動子/RBS替換方法難以在染色體原位實現多基因同時、精準、可擴展的調控，限制了其在代謝通路系統(tǒng)優(yōu)化中的應用。
近日，中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所研究員王猛團隊基于前期開發(fā)的堿基編輯平臺BETTER，建立了枯草芽孢桿菌的多位點堿基編輯系統(tǒng)bsBETTER，實現了在枯草芽孢桿菌中對12個關鍵代謝基因同時調控，并在每個基因位點上獲得了256種理論核糖體結合位點組合中的255種變體，拓展了多基因表達調控的深度與分辨率。
研究以番茄紅素合成為模型通路，靶向調控MEP途徑及下游合成模塊的12個關鍵基因，通過堿基編輯在染色體原位構建高多樣性核糖體結合位點文庫，并結合高通量篩選和深度測序，獲得了番茄紅素產量提升6.2倍的工程菌株。多組學分析表明，bsBETTER介導的多基因協(xié)同調控重構了MEP通路的代謝通量與氧化還原輔因子平衡，增強了糖酵解、磷酸戊糖途徑和TCA循環(huán)的整體代謝活性，提高了NADPH與ATP的再生能力，實現了系統(tǒng)層面的代謝重編程。研究同時揭示了不同基因核糖體結合位點強度的上下游依賴關系：上游限速酶基因保持中低表達更利于代謝平衡，下游關鍵合成酶的高強度表達可有效促進產物積累。
研究為進一步提升篩選與驗證效率，建立了兩個自動化高通量平臺體系。一是番茄紅素高通量篩選平臺，實現了從孔板發(fā)酵、自動化萃取到HPLC/UPLC-MS定量分析的全流程集成，可快速完成上萬株突變體的并行篩選與驗證，提升了表型檢測通量和結果準確性；二是基于CRISPR的自動化基因組編輯與驗證平臺，可實現從編輯質粒設計與構建、突變體構建、質粒清除到菌株培養(yǎng)及熒光驗證的全自動化操作，提高了多基因編輯效率與重現性，為復雜代謝調控提供了標準化工程基礎。
相比于傳統(tǒng)的啟動子工程或CRISPRa/i方法，bsBETTER無需外源供體模板、不依賴重組、無雙鏈斷裂，具有高效率、強宿主適配性與可擴展性等優(yōu)勢，為多基因通路的優(yōu)化和系統(tǒng)重構提供了新技術路徑，有望推廣應用于維生素、色素、脂肪酸及多肽等多類高附加值化合物的生物制造過程。
相關研究成果在線發(fā)表在《代謝工程》（Metabolic Engineering）上。研究工作得到國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、中國科學院戰(zhàn)略性先導科技專項的支持。
論文鏈接
自動化高通量平臺體系
本文鏈接：枯草芽孢桿菌染色體研究取得進展http://m.sq15.cn/show-12-2006-0.html
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